ASPIRACIÓN FOLICULAR Y FERTILIZACIÓN IN VITRO (OPU/FIV) COMO HERRAMIENTA PRODUCTIVA EN GANADERÍA DE LIDIA.

ASPIRACIóN FOLICULAR Y FERTILIZACIóN IN VITRO (OPU/FIV) COMO HERRAMIENTA PRODUCTIVA EN GANADERíA DE LIDIA

Ramón González Domínguez. 
Dr. Veterinario. Embriones del Sinú. Colombia.




Durante las últimas décadas hemos sido testigos de una verdadera revolución tecnológica, la aplicación masiva de herramientas productivas como la biotecnología a nivel de granja ha alcanzado niveles que hace solo algunos años considerábamos imposibles. La demanda por fuentes de proteína de alta calidad y bajo costo, consecuencia de un aumento constante de la población mundial, ha estimulado a profesionales, investigadores e industrias relacionadas con el sector agropecuario alrededor del mundo a desarrollar Biotecnologías Reproductivas capaces de integrarse a la cadena productiva.

Dentro de estas tecnologías, la Aspiración Folicular y Fertilización In Vitro (OPU/FIV) se perfila como una de las herramientas más eficientes en programas de mejoramiento genético y es sin lugar a dudas unas de las de mayor crecimiento. Aunque los primeros reportes de la aplicación de la técnica en bovinos aparecieron hacia el año 1988, fue durante la última década, gracias a la estandarización de medios de cultivo FIV y al desarrollo de una serie de tecnologías y procesos relacionados, como la Transferencia de Embriones no quirúrgica, Protocolos de Sincronización de Receptoras eficientes y mano de obra especializada que fue posible aplicarla a una escala comercial. Según datos de la International Embryo Transfer Society (IETS) son transferidos anualmente alrededor del mundo cerca de 400.000 embriones FIV, que representa un crecimiento del 700% en la cantidad de embriones transferidos por esta tecnología en los últimos 9 años.

La OPU FIV como otras biotecnologías reproductivas está enfocada esencialmente en aumentar la cantidad de crías obtenidas por animal por año, a partir de animales genéticamente superiores según parámetros zootécnicos establecidos por un determinado criador o industria.

Esta herramienta tecnológica está basada en un principio simple, aprovechar el enorme potencial de Oocitos (óvulos inmaduros) presentes en los ovarios de las donadoras, los cuales están en capacidad (bajo las condiciones adecuadas) de producir animales nacidos viables. Para entender mejor este concepto es necesario recordar un poco los mecanismos fisiológicos del sistema reproductor de la hembra bovina.

Los ovarios son estructuras vivas que están en constante dinamismo, todo el potencial reproductivo de la hembra se encuentra en ellos. Así, al momento del nacimiento cuenta con aproximadamente 300.000 Oocitos disponibles para usar durante su vida reproductiva, cantidad bastante considerable teniendo en cuenta el hecho, que para este momento, esta recién nacida es posible que haya perdido cerca del 85% del total de Oocitos con los que llego a contar en su estado fetal (cerca de 2.000.000 al día 130 de gestación). Este número a diferencia del macho, no aumentara, debido a que la célula germinal no sufre más divisiones, por el contrario, con cada onda de reclutamiento folicular que inicia su desarrollo, la cantidad de Oocitos primordiales disponibles en el ovario disminuye.

De esta cantidad inicial, a partir del momento del nacimiento y hasta que su reserva de Oocitos se termine, cada semana un grupo de folículos sale de su estado de arresto meiótico (hibernación biológica), e inicia un patrón de crecimiento bajo el control de un complejo proceso fisiológico conocido como Ondas Foliculares, cada onda tiene una duración aproximada de 7 días. Dicho patrón semeja una carrera donde el folículo que alcanza mayor tamaño causa la atresia (degeneración y muerte) de los demás que compiten con él, llega a ser dominante y puede ser ovulado finalmente, después de un ciclo que por lo general involucra de 2 a 3 ondas foliculares. Este proceso se repite casi ininterrumpidamente aproximadamente a cada 21 días.

Considerando las particularidades de este funcionamiento y mirando las cosas desde el punto de vista matemático se calcula que el aprovechamiento de Oocitos es inferior al 0,01%. La razón es muy simple, un animal ciclando normalmente en un periodo de 15 años ovularía menos de 300 Oocitos (ovulando a cada 21 días o 17,4 veces por año, multiplicando por 15 años = 260 ovulaciones, sin contar los periodos de gestación durante los cuales no hay ovulación, pero si ondas foliculares).

Al final, con solo 300 óvulos liberados (aptos para la fecundación) y bajo condiciones de explotación excepcionales donde fuese posible obtener una cría por año, esperaríamos obtener de esa hembra durante su vida reproductiva unas 10 crías. Lo que significa que desaprovechamos aproximadamente el 99,99% del potencial reproductivo que esta donadora nos puede ofrecer.


TéCNICA
La técnica de aspiración folicular o OPU (Ovum pick-up) es un procedimiento mediante el cual los Oocitos inmaduros son recolectados directamente desde los folículos visibles en el ovario, por lo general es realizada por vía transvaginal, aunque existen reportes de algunos equipos de investigación que utilizan laparoscopia o punción lumbar.

La OPU es una técnica sencilla y de alta repetitividad, es posible realizar hasta 2 sesiones OPU por semana, cada sesión demora alrededor de 15 minutos por individuo, en manos de un técnico experimentado presenta mínimos riesgos para el desempeño reproductivo presente o futuro de la donadora. La aplicación de la técnica tiene mínimas restricciones compradas con otras tecnologías similares, es posible realizar procedimientos de OPU en casi cualquier donadora sin importar su estado reproductivo o condición fisiológica.

Como no es necesaria la aplicación de ningún tipo de protocolo de estimulación ovárica y la técnica se enfoca en la población folicular presente en el ovario durante cualquier momento del ciclo estral, en términos prácticos es posible realizar procedimientos OPU aún a donadoras con condiciones especiales, tales como: donadoras prepúberes, donadoras de edad avanzada, donadoras con problemas reproductivos (quistes, piometras, mucometras, anovulación etc), donadoras preñadas o recién paridas (siempre que permitan al técnico la manipulación de los ovarios), etc.


EQUIPO
ECóGRAFO: Se utiliza un equipo de ultrasonografia convencional, actualmente la mayoría de los equipos del mercado tienen la opción y los accesorios necesarios para realizar procedimientos de OPU

GUIA DE ASPIRACIóN: consta de varias partes: a) Soporte para el transductor, está construido en teflón o materiales similares que permiten una adecuada higiene y esterilización, b) Transductor, permite la visualización de los Folículos Ováricos, por lo general se manejan transductores sectoriales de frecuencias de 5 a 7 MHz, que permiten visualizar folículos desde 2 mm de diámetro c) Guía de punción, permite al técnico controlar los movimientos de la aguja sobre la superficie del Ovario, d) Sistema de Conducción, lleva el liquido folicular aspirado desde el folículo hasta el tubo de colecta, por lo general es de silicona o teflón d) Aguja OPU, puede variar la longitud y el calibre según la preferencia del equipo de trabajo.

BOMBA DE VACíO: Este equipo provee una presión negativa constante que aspira el liquido folicular en el cual se encuentra el Oocito, la mayoría de los equipos utilizan para el caso de OPU en bovinos presiones de vacío entre 50 a 100 mmHG (milímetros de mercurio) suficientes para lograr buenos promedios de recuperación sin alterar la calidad estructural del Ovulo.





PROCEDIMIENTO OPU
ANESTESIA: El procedimiento inicia con la aplicación de una anestesia epidural baja, para la cual se utiliza Lidocaína al 2%. El objetivo es disminuir las contracciones y movimientos peristálticos con el fin de permitir al técnico una manipulación adecuada del ovario.

PALPACIóN: El técnico debe realizar una evacuación completa del contenido rectal de la donadora, tras de lo cual procede a realizar un diagnostico reproductivo por palpación rectal y a la ubicación de los ovarios. De esta manera determina el orden de aspiración a seguir y en algunos casos, posibles inconvenientes que impidan realizar un adecuado procedimiento.

LIMPIEZA: Es necesario realizar una adecuada limpieza del área perineal con agua en abundancia, preferiblemente se recomienda utilizar junto con desinfectantes del tipo amonio cuaternario o similares.

ASPIRACIóN FOLICULAR: Una vez realizados todos los pasos previos el técnico procede a introducir el equipo OPU a través de la vagina, con la mano izquierda va manipulando el ovario de manera que pueda acceder a cada folículo y con la ayuda de la guía de aspiración va introduciendo la aguja en cada uno de ellos. En la pantalla del ultrasonido observa que el líquido folicular sea aspirado completamente hasta el colapso de la pared folicular, para inmediatamente realizar el mismo procedimiento en un nuevo folículo, hasta que el ovario quede completamente limpio. Por regla general se aspiran todos los folículos mayores de 2 milímetros.

Una vez todos los folículos son aspirados, el técnico hace un lavado a presión del sistema de conducción para asegurarse que todo el liquido folicular recuperado caída dentro del tubo colector. Con esto finaliza el procedimiento, cada tubo es debidamente identificado y procede hasta el laboratorio donde otro técnico se encargara del proceso de búsqueda y selección.

BúSQUEDA Y SELECCIóN: Con la ayuda de un estereoscopio y después de pasar a través de un filtro colector donde se separan los Oocitos de restos de sangre y otros detritos celulares que pueden venir dentro del tubo, el técnico realiza una búsqueda de todas las estructuras recuperadas. Posteriormente es necesario hacer una clasificación cualitativa de los Oocitos antes de proceder a su empaque en un medio de maduración para su traslado al laboratorio.



VENTAJAS
Un programa comercial OPU/FIV permite:
• Aumento en el numero de crías obtenidos por animal por año
• Disminución del intervalo generacional (OPU donadoras jóvenes)
• No utiliza ningún tipo de protocolo hormonal en las donadoras
• Alta repetitividad, es posible hacer aspiraciones en la misma donadora hasta 2 veces por semana.
• Permite trabajar donadoras no aptas para ser utilizadas en otras técnicas, sin comprometer su desempeño reproductivo presente o futuro (animales preñados, prepúberes, geriátricos, con patologías reproductivas etc).
• Mayor aprovechamiento del semen (1 pajilla alcanza para fertilizar hasta 15 vacas)
• Excelentes resultados con semen sexado (90% nacimientos de sexo determinado)
• Permite y facilita el comercio de material genético entre regiones variadas con mínimo riesgo biológico.



EMBRIONES DEL SINU
EMBRIONES DEL SINú es una empresa de Biotecnología Reproductiva cuya misión es poner a disposición del gremio ganadero las últimas técnicas de reproducción asistida, nuestro principal campo de acción se enfoca en la producción de preñeces por la técnica OPU/FIV. Desde el 2008 hemos producido más de 12.000 preñeces FIV en Latinoamérica.

Embriones del Sinú, nace de la alianza de un grupo de ganaderos y veterinarios pioneros en la técnica OPU/FIV, enfocada desde un punto de vista comercial y garantizando resultados. El sistema de trabajo es por preñez confirmada de 70 días, por lo que contamos con un grupo profesional multidisciplinario que se encarga de cada etapa del proceso.

En nuestra experiencia con la técnica, podemos afirmar que la media general de preñeces obtenidas por animal/sesión es de 3 preñeces. Esta media puede variar dependiendo de la raza de la donadora y del potencial individual que esta pueda expresar. Considerando que los intervalos de aspiración para una donadora en condiciones comerciales varían por lo general de 15 días a un mes, la cantidad de preñeces obtenidas por donadora por año usando la OPU/FIV puede rondar los 50 individuos. Las medias de recuperación de Oocitos varían según la raza y potencial individual de la donadora (además de otros aspectos biológicos y de manejo) pero puede dividirse en 2 grupos muy representativos, la media de Oocitos recuperados para la razas indicus es de 30 Oocitos/sesión y para las razas taurus es de 12 Oocitos/sesión.

Las medias de producción de laboratorio Oocito/Embrión varían por regla general entre el 20 al 35%, dependiendo en gran medida de la calidad y tipo del semen utilizado (convencional o sexado). Los porcentajes de preñez obtenidos por nuestro equipo de trabajo rondan en el 40% calculado en base a un número de más de 31.000 embriones transferidos en 3 años de trabajo.

En la actualidad aunque nuestro principal campo de acción son las explotaciones de razas puras, nuestro interés principal se enfoca en hacer viable esta tecnología a ganaderías comerciales, es así como desde el 2009 estamos trabajando en un macroproyecto con el sector lechero para la producción de preñeces FIV de animales de raza Gyrolando (F1 Gyr x Holstein con semen sexado), de los cuales se han producido en este periodo de tiempo cerca de 1500 preñeces. Este enfoque busca hacer preñeces a bajo costo, para producir animales eficientes, adaptados a las condiciones de nuestro país. Además se viene realizando trabajos para la multiplicación de las razas bovinas criollas las cuales son consideradas en la actualidad razas en peligro de extinción.


EXPERIENCIA EN GANADO DE LIDIA
Colombia es un país apasionado por la fiesta brava, la cual se vive y goza en una gran cantidad de regiones a lo largo y ancho del territorio en sus más variadas expresiones, con temporadas taurinas de reconocimiento internacional. Sin embargo es bien conocido en nuestro gremio que la utilización de herramientas biotecnológicas utilizadas para la reproducción del ganado de Lidia es relativamente baja, comparada con otro tipo de explotaciones ganaderas. En general se vienen realizando trabajos con Inseminación Artificial a Tiempo Fijo IATF y Transferencia de Embriones por Lavado Convencional MOET desde hace algunos años, por un selecto grupo de ganaderos.

Los primeros trabajos en OPU/FIV con la raza de Lidia en Colombia, inician en el año 2010 con la ganadería LAS VENTAS DEL ESPIRITU SANTO de propiedad del maestro CESAR RINCON. La inquietud por la tecnología, surge gracias a la difusión mediática de los resultados obtenidos por trabajos en OPU/FIV utilizando semen de alto valor comercial para la producción de un número mayor de animales con una sola dosis de semen. Inicialmente el objetivo era reproducir un grupo de donadoras elite de su propiedad, utilizando semen muy escaso, de alto valor monetario.

Los resultados obtenidos hasta el momento demuestran que la técnica OPU/FIV es perfectamente aplicable al ganado de Lidia, sin embargo es necesario hacer algunas mejoras en varios temas, especialmente los relacionados a donadoras aspiradas, cantidad y calidad de los Oocitos recuperados, toros utilizados por procedimiento, calidad seminal, y tipo de receptoras utilizadas (raza de lidia o razas criollas).

OPU DONANORAS OOC. TOT CULTIVO EMB D7 TE P+



05/04/2010 8 90 75 31 21 8
19/05/2011 1 11 7 1 0 0
26/08/2011 11 69 60 15 9 Pend.

TOTAL 20 170 142 47 30 8

PROMEDIO 8,5 7,1 2,3


La cantidad de Oocitos recuperados por donadora fue de 8,5 estructuras, considerando los promedios establecidos para razas taurus podemos considerar que la media es baja. Sin embargo es muy importante tener en cuenta varios aspectos: a) La cantidad de individuos que entraron al procedimiento OPU ha sido limitada y por el momento pertenecen a una sola explotación, lo cual nos sugiere que la cantidad de datos obtenidos no basta para determinar con certeza una media para la raza de Lidia. b) Una parte importante de las donadoras sujetas hasta el momento a los procedimientos OPU/FIV son animales de edad avanzada, las cuales presentan mayores posibilidades de mostrar baja población folicular c) La raza de lidia ha sido seleccionada a través del tiempo por sus características físicas y de comportamiento, dejando de lado la presión de selección por fertilidad que han tenido razas con otros fines productivos, factor que podría explicar de cierta manera la población folicular observada hasta el momento en el ganado de Lidia.

Hasta la fecha han sido utilizados 5 toros de la raza de Lidia para los procedimientos FIV, entre los cuales ha existido una muy interesante variación en la cantidad de embriones producidos para cada uno. Con rangos de producción Oocito/Embrión del 11 al 35%, como en el caso de las donadoras, la cantidad de Oocitos trabajados con cada individuo es limitada, lo cual nos impide por el momento sacar conclusiones sobre el comportamiento especifico de cada toro y/o partida de semen a utilizado a la fecha. Sin embargo las observaciones y datos obtenidos al momento destacan la producción de dos de los toros, sería muy interesante realizar algunas pruebas con Oocitos de matadero para determinar el comportamiento satisfactorio de toros candidatos o partidas de semen a utilizar para futuros procedimientos OPU/FIV, garantizando resultados exitosos, esto no siempre es posible considerando el costo comercial o la poca disponibilidad de pajillas de algunos de los animales más valiosos.


TORO OOCITOS CIV EMB D7 % EMB
ALCALDE 90 31 34,4%
GRACIOSO 11 4 36,4%
IRRITADO 38 8 21,1%
HURTADOR 14 2 14,3%
EXTRAVIADO 17 2 11,8%
TOTAL 170 47 27,6%


Del procedimiento realizado en el 2010 nacieron finalmente 8 productos, 4 hembras y 4 machos hijos del toro Alcalde, obtenidos utilizado una sola dosis de semen. Estos embriones fueron transferidos en receptoras mestizas, la gestación así como el proceso del parto fue completamente normal. El desarrollo y peso al destete de los recién nacidos ha sido superior a animales contemporáneos obtenidos por inseminación artificial o monta natural, esto probablemente por la mayor disponibilidad de alimento que ofrecen las receptoras de esta raza.

En comunicación personal con el señor Cesar Rincón, se sugiere la posibilidad de utilizar receptoras de Lidia para los nuevos procedimientos por cuestiones de disponibilidad y costos, por lo que en el último procedimiento OPU/FIV realizado, fueron transferidos 9 embriones 5 de ellos fueron transferidos en receptoras de esta raza.
En conclusión, la implementación exitosa de la tecnología OPU/FIV en ganado de Lidia es posible, las características de la técnica se acomodan perfectamente con muchas de las necesidades de los criadores de esta raza, en especial la posibilidad de reproducir donadoras de alto valor genético que por su condición especifica (edad, estado reproductivo, etc) no aplican para otras tecnologías o a obtener una cantidad de crías mayor por individuo/año. Además abre la posibilidad de obtener productos de grandes reproductores de los cuales la cantidad de semen disponible es muy limitada o de costo comercial elevado. 
Esto abre nuevas perspectivas para el arte y el espectáculo del toro.